Yapısal biyoloji

Bir lizozim kristalinin kırınımı

Kristalografik yapının çözünürlüğü X ışınlarının makromolekül kristallkeri üzerindeki kırınımlarının incelenmesne dayanır. Elektronlera çarpan X ışınları kırınıma uğrar ve molekülün elektron yoğunluğunu yani molekülün çevresinde dönen elektronlerın yerini bulmak için analiz edilebilir. Bu yoğunluk yeteri kadar belirgin ise molekülün her bir atomunun yerini tespit etmeye yani kartezyen koordinatlarını belirlemeye yarar.

Elektron yoğunluğu ve atomların konumu

Bu analiz yönteminin ön koşul moleküllerin kristallerinin elde edilmesidir. Uygun fiziksel ve kimyasal koşullar altında çözelti içindeki makromoleküller kristaller oluşturabilir. Bir molekülden diğerine değişkenlik gösteren bu uygun fiziksel ve kimyasal koşulların saptanması çoğunlukla ampiriktir. Ayrıca molekülün saflık derecesi de belirleyici faktörlerden biridir. Dolayısıyla ön koşul olan kristalleşme etabı bu tür analiz için genellikle sınırlayıcı olmaktadır.

Onlarca ya da yüzlerce mikron büyüklüğünde yeterli kristal boyutuna erişildiğinde monokromatik X ışını hüzmesi altına getirilir. Uygun koşullar altında kristal yapı içinde dizilmiş elektronlara çarpan X ışınları krınıma uğrar. Bir sensör yardımıyla, kristalin farklı oryantasyonları için kırınım desenleri kaydedilir. Desen üzerindeki lekelerin arasındaki boşluk kristal yapı hakkında bilgi verir. Lekelerin şiddeti de kristal yapı içindeki her bir makromolekülün elektron yoğunluğu hakkında bilginin bir kısmını sağlar. Her bir leke ile bağlantılı sinyal fazı ise kaybolduğundan yeniden oluşturulmalıdır. Bu fazları oluşturmak için farklı yöntemler kullanılır:

• Çoklu izomorf replasmanı kristal içine elektron zengini olan ağır atomları yaymak ve kristalin kırınımını ağır atomlar ile ve ağır atomlar olmadan kıyaslamaktır. Ağır elementlerin varlığı kırınım şiddetini hafifçe değiştirdiği için veri üçlemesi yoluyla fazları hesaplamak mümkün olabilmektedir;
• Anormal saçılma molekülün içinde yer alan atomlardan bir türünün soğurma eşiği çevresinde X ışınlarının boyunu değiştirme yöntemidir. Özellikle kullanılan dalga boylarına (0,1 nm) yakın bir soğurma eşiğine sahip olan selenyum sıklıkla kullanılır. Proteinler için genellikle biyosentetik yoluyla sokulan selenosistein ya da selenometiyonin gibi amino asitler kullanılır;
• Moleküler replasman ise bilindiği takdirde eşlenik bir protein yapısının kullanılması yöntemidir. Eşlenik yapı kristalin içine sokulmaya çalışıldıktan sonra teorik kırınımı hesaplanır ve gözlemlenen kırınım ile kıyaslanır. Bu şekilde teorik öncül fazlar hesaplanabilir.;

Bir kere fazlar hesaplandıktan sonra kırınım sinyallerinin Fourier dönüşümü ile elektron yoğunluğu elde edilir. Böylece molekülün her bir atomunun kartezyen koordinatlarını elde etmeye olanak sağlayan otomatik sistemler ya da interaktif grafik yazılımları kullanılarak elektron yoğunluğu yoluyla molekül yeniden oluşturulmaya çalışılır. Model oluşturulduktan sonra kırınım şiddetleri teorik olarak bu modele göre hesaplanır ve deneysel olarak elde edilen şiddet değerleri ile kıyaslanır. Böylece aşamalı olarak model geliştirilir.

Bir toksinin nükleer manyetik rezonans ile elde edilen yapısı

Nükleer manyetik rezonans ya da NMR molekül üzerine uzaklık ve açı gibi geometrik bilgileri elde etmek için atom çekirdeklerinin manyetik özelliklerini kullanır. Elde edilen bu geometrik bilgilerle bir çeşit veri üçlemesi yöntemi kullanılarak molekülün üç boyutlu yapısını hesaplamak mümkündür.

Özellikle hidrojen ¹H, karbon ¹³C ve azot ¹⁵N gibi belirli atomların çekirdekleri spin adı verilen açısal momentuma sahiptir. Bu spin bi manyetik dipol momenti ile bağlantılıdır. Tipik olarak 10 ila 20 Tesla büyüklüğünde çok şiddetli bir manyetik alana yerleştirildiklerinde bu spinler manyetik alan ile aynı doğrultuya gelir. NMR, moleküldeki spinler arasındaki etkileşimleri inceler ve asıl olarak iki türlü etkinin gözlemlenmesine olanak verir. Birincisi elektron çiftleri arasındaki bağlarda görülen skaler etkileşimlerdir. Bu skaler etkileşimler molekülün kovalent bağları ile oluşan birleşimleri belirlemeye olanak sağlar ve böylece molekülün topolojisi çıkarılabilir. Topoloji bu bağların geometrisine ve özellikle de atomlar arasındaki ikidüzlemli açılara bağlıdır. İkincisi nükleer Overhauser etkisi adı verilen ve uzam içinde manyetizasyon transferine karşılık gelen dipolar etkileşimlerdir. Bu etkileşimler yalnızca atomlar arasındaki uzaklıklara bağlıdır ve atomlar arasındaki bağların geometrisinden bağımsızdır. Ayrıca yalnızca 0,5 nm civarında iseler gözlemlenebilirler.

Biyomoleküler nükleer manyetik rezonans spektroskopisi çözelti içindeki makromolekülleri örnek olarak kullanır ve alınan spektrografilerle hem skaler hem de dipolar etkiler arasındaki ilişkileri kaydeder. Alınan spektrografilerden farklı sinyallerin analizinin gerçekleştirilmesiyle molekülün her bir atomu birer birer belirlenebilir. Bundan sonra molekülün geometrik verileri toplanır ve alınan spektroskopi sonuçları ile birleştirilerek molekülün üç boyutlu yapısı hesaplanır.[6]. Bu hesaplamalar iterasyon yöntemi ile tek bir çözüme ulaşılana kadar devam eder.

Kriyo-elektron mikroskobu ile elde edilen brüt görüntü. Farklı oryantasyonlarla şaperon GroEL proteini görülmektedir.

Marburg virüsü protein kılıfının kriyo-elektron mikroskobu ile alınan görüntüsü.

Kriyo-elektron mikroskobu karmaşık makromoleküllerin yapılarının düşük çözünürlüklü görüntülerini elde etmeye yarar. İncelenek olan makromolekül sıvı azot banyosu içinde tutulan sıvı etan gibi kriyojenik bir sıvının içine hızlıca batırılıp çıkarılarak dondurulur. Bu koşullar altında çözelti içindeki su, içindeki makromoleküllerin biçimlerini koruyacak şekilde amorf hâlde katılaşır.

Bu aşamadan sonra elektron mikroskobuyla buz içinde katılaşan molekülün farklı oryantasyonlarda resmi elde edilir. Bilişim yöntemleri ile bu farklı resimler sınıflandırılarak benzer bir oryantasyonda incelenen biyolojik nesnelerle karşılaştırılarak gruplandırılır. Gruplana bu resimlerin her birinde arkaplan gürültüsünün azaltılması için resim çözümleme teknikleri uygulanır.

Bu veri işleme sonrasında, incelenen üç boyutlu yapının dikey izdüşümlerine karşılık gelen hassas iki boyutlu resimler elde edilir. Yeniden bilişim yöntemleri kullanılarak bu iki boyutlu resimlerden molekülün çevresel olarak üç boyutlu yapısı oluşturulur. Hassas bir üç boyutlu yapı elde etmek için genellikle birkaç bin kadar iki boyutlu resim kullanılır. Simetrik olmayan yapılar için bu oluşturulan üç boyutlu desenlerin hassasiyeti 1 ila 2 nanometre civarındadır. Hatta daha iyi belirlenmiş yapılar için hassasiyet nanometre altına düşer.

Virüslerin protein kılıfları gibi simetrik oligomerlerde elde edilen üç boyutlu resmin hassasiyetini artırmak için simetri bilgisi de kullanılarak modelleme yapılır.

Küçük açılı saçınım teknikleri çözelti içinde bulunan nesnelerin boyutları ve biçimleri hakkında bilgi toplamaya olanak sağlar. Biyolojik saçınım yöntemlerinde makromoleküllerin oligomerizasyon durumu ve biçimleri üzerine düşük çözünürlüklü veri elde edilebilir.[7]. Yapısal biyolojide iki farklı küçük açılı saçınım yöntemi kullanılır: X ışınları saçınımı (SAXS: small angle X-ray scattering) ve nötron saçınımı (SANS : small angle neutron scattering')

Bu deneysel yöntemlerin prensipleri aslında basittir. Üzerinde çalışılacak makromolekülün konsantre çözeltisi paralel X ışınları ya da nötron akışı içine yerleştirilir. Çözelti içindeki nesneler üzerlerine düşen dalgaları saçılıma uğratır. X ışınlarında saçılma elektron bulutu ile fotonlar arasındaki etkileşimdem kaynaklanırken nötronlarda ise çözeltideki molekülün atom çekirdekleri ile oluşan etkileşimden kaynaklanır. Saçınıma uğrayan sinyalin şiddeti farklı açılara göre tespit edilir. Üzerinde çalışılan molekülün tüm oryantasyonları için bir ortalama değer olan sinyal sonucunda molekülün boyutu ve dış kabuk biçim hakkında bilgi edinilir. Özellikle virüsler gibi içsel simetri sahibi moleküller için 1 nanometrelik çözünürlüğe kadar hassas modeller elde edilebilir.

Moleküler modelleme yapısal biyoloji ile biyoenformatik dallarının kesişiminde olan bir yöntemlerbütünüdür. Moleküler yapıları oluşturmak, yapısal tahminlerde bulunmak[8] ya da makromoleküllerin dinamik özelliklerini analiz etmek için bilişsel yöntemlerle yapılan hesaplama yöntemlerini içerir. Minimal enerji için atomların hareket etmesini sağlayan moleküler kuvvetlerin tanımlamasına dayanır.